在前面的推文中伯小远给大家介绍过“暗物质”——增强子。那么什么是“暗物质”？简单来说就是那些不容易被发现，但是功能又较为重要的物质。因为很多常规的知识伯小远已经给大家伙儿一起来分享的差不多了，所以小远要一直开拓新的领域给大家，今天将要给大家介绍的是另一种“暗物质”——小肽。

  小肽（Small peptide），宽泛来讲是指在长度上少于100个氨基酸的蛋白，但也有人定义为5~60个氨基酸长度的蛋白为小肽。关于小肽的定义标准并不统一，也有人研究的小肽长度超过100个氨基酸(Hu et al., 2021; Matsubayashi Yoshikatsu, 2014)。因此，可以将长度不超过150个氨基酸的蛋白统称为小肽。

  小肽不容易被识别，因为基因注释和蛋白质分析程序通常优化为识别大蛋白质。此外，由于一些sORF(小的开放阅读框)不以AUG起始密码子开始，因此很难将它们与非编码RNA或小肽编码ORF区分开来。总的来说，大多数sORF在功能上未被表征，因此小肽被认为是植物中的“暗物质”，它的潜力被低估了很长一段时间。

  小肽能够准确的通过其基因组起源分为编码与非编码基因衍生的小肽，也能够准确的通过其分布分为分泌肽与非分泌肽。

  核糖体RNA（rRNA）是细胞中最丰富的RNA，作为结构RNA介导翻译。然而，大肠杆菌的23S rRNA编码一个功能性的五肽(Tenson et al., 1996)（图1C）。此外，线S rRNA编码一种功能性肽，有望用于阿尔茨海默氏症和癌症治疗(Maximov et al., 2002)。一个鼓舞人心的观点可能揭示了结构rRNA具有编码蛋白质的能力的原因。具体来说，rRNA被认为是mRNA编码核糖体蛋白的大多数来自(Root-Bernstein and Root-Bernstein, 2016)。然而，总的来说，rRNA编码肽的证据是非常罕见的，在植物中目前还没有相关的案例。

  编码基因衍生的小肽能够准确的通过其在基因中的相对位置进一步分为不一样的类型。上游小肽是从编码基因的5’未翻译区（UTR）内的ORF（uORF）中翻译出来的（图1E）。下游的小肽是从3’UTR内的ORF中翻译出来的。编码小肽的基因在叶绿体中广泛存在。

  另一种类型的植物小肽来源于一种长长的前肽（一种完全编码的成熟蛋白，经过翻译后修饰而得到）（图1G）。翻译后处理产生成熟的功能小肽(Matsubayashi Yoshikatsu, 2011)。这些肽也被称为激素样肽，因为它们作为配体，以细胞对细胞的方式与细胞膜上的受体结合，类似于激素的作用，如CLE、RALF和FER(Takahashi et al., 2019)。

  图1 来自不同基因组起源的小肽示意图(Feng et al., 2023)。（A）一种microRNA编码的肽。（B）LncRNA编码的小肽。（C）rRNA编码的小肽。（D）环状RNA编码的小肽。（E）上游小肽。（F）非典型CDS小肽。（G）小信号肽。

  分泌小肽在细胞外发挥作用，在细胞外合成并通过传统的蛋白质分泌途径（通过高尔基体或反式高尔基网络）或非传统的蛋白质分泌途径（直接通过内质网或多泡体（细胞内存在于高尔基体周围的一种细胞器））输出细胞外(Hu et al., 2021)。迄今为止鉴定的大多数小肽都是分泌肽，它们与其他常见的分泌蛋白相似，并在N端携带先导序列。

  分泌小肽具体又分为两类：一类是通过复杂的翻译后修饰（最重要的包含酪氨酸（Tyr）硫酸化、脯氨酸（Pro）羟基化和羟脯氨酸（Hyp）糖基化），接着进行广泛的蛋白水解过程而产生的，被称为翻译后修饰小肽；另一类以存在多个分子内二硫键为特征，并且此类信号肽中一些经历蛋白水解过程，一些不经历蛋白质水解过程，但都被统一定义为富含半胱氨酸多肽。

  图2 在整个分泌途径中含有PTMs和富含半胱氨酸多肽的加工(Olsson et al., 2019)。大多数肽配体被合成为前肽，其中包含一个分选序列，引导前肽进入分泌途径。进入内质网后，分选序列被信号肽酶切断。对于携带PTMs的多肽，修饰是在整个内质网和高尔基网络中引入的：P4H酶引入脯氨酸羟基化，TPST引入Tyr硫酸化，HPAT、XEG113和RRA1-3引入Hyp阿拉伯糖基化。一般观点认为肽配体在整个分泌途径中被蛋白水解处理，在某些情况下，也可以在细胞外空间产生活性肽配体。对于富含半胱氨酸家族的肽，二硫键的形成和在某些情况下的蛋白水解过程发生在整个分泌途径和细胞外空间，由此产生活性肽。

  非分泌性小肽通常缺乏N端信号序列，因此，它们被保留在细胞中。它们包括两种类型的肽：介导细胞通信与膜结构的跨膜肽和在信号网络中起调节作用的细胞内肽(Xu et al., 2017)。然而，在某些情况下，非分泌性小肽可以从细胞中释放开来，并在细胞间传递信号，以响应损伤。

  相较于动物中鉴定到的小肽数量，植物中鉴定到的小肽总体较少，极大限制了小肽的开发与应用。但植物的复杂性、不可移动性和无时无刻需要适应外界环境的特性，使得我们有理由相信植物中还有大量的小肽迄待挖掘。

  目前质谱等肽组学（Peptidomics）的研究方法和生物信息学手段是鉴定小肽的主流方法，但肽组学在植物中的应用一开始并不是很顺利，原因见下：①植物组织复杂，富含各种次级代谢产物和极低的植物信号肽浓度，给小肽的分离带来了困难；②小肽小，可能不含有胰肽酶的切点，或者切出来的片段过小，超出了质谱检测下限；③新的蛋白质或肽段的质谱鉴定在很大程度上取决于对蛋白数据库的检索和比对，植物小肽数据库的局限性是肽组学技术的瓶颈之一。直到2014年，随着质谱仪器灵敏度的提高，Chen等人在植物中建立了新型肽组学技术，这样一些问题才慢慢被解决(Chen et al., 2014)。

  基于表型筛选的传统正向遗传学对基因功能的研究功不可没，但是对于小肽的鉴定效果并不理想，只鉴定到为数不多的小肽，主要是由于小肽及其前体来源广、复杂程度高，并且存在功能冗余，极大限制了通过正向遗传学的突变体表型研究来发现小肽和其生理功能的研究。1999年和2003年，在拟南芥中通过正向遗传学的方法分别鉴定到了CLV3和INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION（IDA）两个小肽基因(Fletcher et al., 1999；Butenko et al., 2003)。2003年以后，拟南芥中再没有通过经典遗传学鉴定到小肽基因。

  研究植物小肽的分子机制能够在一定程度上帮助科学家更好地改善作物性状或将其应用于农业生产。目前已知的植物小肽的分子机制包括抑制主要ORF（mORF）的翻译、促进miRNA的功能、信号转导以及与靶蛋白的相互作用。

  图3 植物小肽的分子机制(Feng et al., 2023)。（A）MiPEPs（发挥miRNA调节作用的小肽）调节miRNA转录。（B）UPFs介导mORF蛋白的翻译和转录后丰度。（C）与细胞内其它蛋白质相互作用的小肽。（D）与信号转导受体结合的小分泌肽。

  据报道，uORF编码的肽可以减弱或抑制下游mORFs的翻译。当上游小肽翻译时，mORF的核糖体扫描会受到抑制；在某些情况下，当核糖体到达小肽的终止密码子时，就会与mRNA分离，从而触发核糖体停滞导致的无意义mRNA衰减（NMD）(Zhang et al., 2020)（图3B）。

  自从农业出现以来，控制植物病害一直是人类的一项斗争。对植物免疫机制的研究最终出现了通过植物自身防御基因的异位转录来设计抗性作物的策略，例如主免疫调节基因NPR1。然而，通过这一种策略获得的增强抗性通常与作物的适应性损失有关，从而使所得产品不适合农业应用。未解决这个问题，作者寻求了更严格的防御蛋白表达机制。基于作者的最新发现，关键免疫调节因子的翻译，如TBF1，在病原体攻击时迅速被诱导，作者开发了一个“TBF1盒”，不仅包括免疫诱导启动子，还包括TBF1基因的两个病原体应答的上游开放阅读框（uORFsTBF1）。作者证明纳入了uORFsTBF1介导的翻译控制拟南芥和水稻AtNPR1中snc1-1（一种自身激活的免疫受体）的产生，使得在不影响实验室或田间植物适应性的情况下设计广谱抗病性。

  小肽可以作为配体诱导信号转导（图3D）。分泌到细胞外的成熟型小肽，可以识别并结合邻近细胞的膜受体（膜受体通常是受体和辅助受体的复合物形式）；有些小肽也会进行长距离的运输（如通过筛管）后才与相应的受体结合。在小肽-受体信号传导的模式中，小肽首先和受体复合物的胞外域结合，并激活受体胞内蛋白激酶域（Kinase domain），受体激酶进一步通过磷酸化激活信号通路的下游因子，如MAPK级联信号和转录因子等（图6）。

  图6 小肽-受体信号通路的组成和信号传导过程(Olsson et al., 2019)。肽配体诱导反应的特异性能出现在信号事件的不同阶段。缩写：MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；ROS，活性氧；TF，转录因子。

  一些小肽位于特定的细胞器中，因此可能与该细胞器中的其它蛋白质相互作用。小肽也能改变靶蛋白的构象来促进其与其它蛋白质的相互作用。一般来说，通过鉴定小肽相互作用的蛋白质可以更好地理解小肽作用的机制。

  图7 拟南芥中AtZSP1与ROCK1相互作用(Zeng et al., 2022)。（a）酵母双杂交实验结果为AtZSP1与ROCK1相互作用。（b）双分子荧光互补分析显示了本氏烟草叶片中AtZSP1与ROCK1相互作用。（c）Split-LUC实验结果为AtZSP1与ROCK1相互作用。（d）免疫共沉淀实验结果为AtZSP1与ROCK1在体内相互作用。

  关于小肽，小远就给大家介绍这么多，简单回顾一下今天的内容，小远主要给大家介绍了什么是小肽、小肽的来源、小肽的鉴别判定的方法以及小肽在植物调控网络中的作用机制，针对部分作用机制小远也给大家列举了一些改善作物性状或将其应用于农业生产的案例。希望能够通过小远的介绍，大家对小肽能够有一个初步的认识，关于更深入的研究就交给大家自己啦！